ABC

Principi di funzionamento, manutenzione, modifica e autocostruzione dei microscopi e dei loro accessori

Moderatore: Enotria

3nzo
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ABC

Messaggio da 3nzo »

Scusate, ma sono all'ABC, come si dice, e questa domanda ai più sembrerà banale.
In quasi tutti i microscopi c'è almeno un obiettivo più potente ad immersione. Questo significa che :
1- il preparato da osservare in immersione deve essere logicamente montato resina? Questo precluderebbe l'osservazione ai massimi ingrandimenti di un preparato estemporaneo in genere con acqua sotto il coprioggetto.
2- per un preparato estemporaneo, è una eresia pensare immergere il campione in l'olio sotto il copioggetto (ovviamente campioni secchi, senza acqua)?
3- Il fatto che esiste indotazione un obiettivo ad immersione sottintende che anche il condensatore in dotazione sia ad immersione?
Infine, l'immersione preclude la possibilità di rivedere il preparato a ingrandimento minore con obiettivo a secco se non dopo noiosa pulizia. In pretica si usa poco.
Dunadan
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

1- No, puoi semplicemente "lutarlo", cioè sigillare il coprioggetto applicando dello smalto per unghie lungo il suo perimetro. Funziona anche con campioni di acqua, purchè ci sia uno stratto molto sottile di acqua sotto il coprioggetto e che non ci sia acqua che "esce" oltre il perimetro.

2- Non serve, vedi sopra.

3- No, non è assolutamente detto che anche il condensatore sia ad immersione.

L'immersione si può usare anche sempre, dotandosi di soli obiettivi a immersione, per esempio la serie 20x 40x 60x e 100x tutti a immersione. Chiaramente se da un obiettivo a immersione vuoi tornare ad uno a secco andrà pulito bene il coprioggetto prima.
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3nzo
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Dubbio: se il preparato viene lutato (non so se la parola è giusta) andrei ad esaminare in immersione in olio un campione immerso in acqua sotto il vetrino coprioggetto, ma questo non creerebbe problemi di discontinuità ottica?
Dunadan
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

Sì, come sempre quando si osservano campioni in soluzione acquosa
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alex870
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Re: ABC

Messaggio da alex870 »

Ho notato infatti che meno acqua c'è, meglio si vede e migliori vengono le riprese immagini/video
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Antonio7
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Re: ABC

Messaggio da Antonio7 »

Immergilo in glicerina o meglio ancora in olio, vediamo se c'è discontinuità- ;)
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Infatti avevo avanzato l'idea di immergerlo in olio, ma non credo sia possibile. Mi sembra di capire che tutti i preparati da visionare con obiettivi ad immersione in olio devono essere montati in resina, una seccatura non da poco.
Dunadan
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

3nzo ha scritto: 13/10/2018, 16:47 Infatti avevo avanzato l'idea di immergerlo in olio, ma non credo sia possibile. Mi sembra di capire che tutti i preparati da visionare con obiettivi ad immersione in olio devono essere montati in resina, una seccatura non da poco.
Ma assolutamente no........
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Antonio7
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Re: ABC

Messaggio da Antonio7 »

3nzo ha scritto: 13/10/2018, 16:47 ma non credo sia possibile
dopo averlo letto nel forum io lo faccio sempre.
Resina?
forse tu parli di vetrini permanenti. :D
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Si parlo di vetrini permanenti. In altre parole, mi sembra di aver capito che, per forti ingrandimenti con elevato potere risolutivo, è necessario usare obiettivi ad immersione in olio e, per rispettare la continuità del mezzo, con indice di rifrazione simile a quello del vetro, bisogna includere i preparati in Balsamo del Canada o resine sintetiche come Entellan.
Il dilettante è portato allestire rapidamente un preparato temporaneo per soddisfare la sua curiosità, mettendo una sezione o altro fra i vetri (porta e copri) con una goccia d'acqua ed è un peccato che in questo modo non si possa ingrandire al massimo per vedere meglio qualche particolare. Colpa della fisica :D
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Re: ABC

Messaggio da Antonio7 »

Fai una prova prepara due vetrini temporanei con lo stesso campione, in uno come mezzo inclusivo usi l'acqua e nell'altro l'olio, il contrasto forse sarà a favore del primo, ma la risoluzione- :D :D
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

L'uso di acqua tra vetrino e coprioggetto è l'unico sistema possibile quando si osservano organismi acquatici vivi, l'eventuale uso di ottiche ad immersione con altri ingrandimenti è possibile e con ottime caratteristiche in termini di risoluzione, ovviamente se si cerca di ottenere il massimo il montaggio è preferibile sia fatto con adesivi ad alto indice di rifrazione.
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

Scusate ma se immergere tutto in olio per voi non e' un problema (io al contrario uso ormai solo obiettivi ad immersione in acqua), ci sono gli obiettivi metallografici ad alto ingrandimento e alta risoluzione che non fanno uso di copri vetrino, mettete tutto sott'olio e via. :thumbup:
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

Preparati in soluzione acquosa o idratati non si possono immergere in olio........
Poi tutta questa discussione non ha molto senso visti i soggetti e i particolari che andiamo a guardare noi dilettanti, che in genere sono ben al di sopra del limite ottico degli obiettivi. Mi preoccuperei, più della risoluzione, della nitidezza e qualità generale dell'immagine. La correzione delle aberrazioni è quello che apprezziamo maggiormente nelle nostre osservazioni.

Per fare un esempio di quanto NON sia vero che per ottenere risoluzioni elevate si debba necessariamente immergere anche il preparato in olio, vi cito le osservazioni di colture di cellule tumorali in vivo, coltivate su agar o simili direttamente sul coprivetrino e poi osservate con microscopi a fluorescenza nei laboratori. Ecco, anche se su soggetti vivi e in agar, la risoluzione che raggiungono è altissima, spesso ben oltre il limite ottico, a seconda del microscopio che stanno utilizzando. Di certo non potrebbero osservare le cellule in vivo se immerse in olio!
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

In conclusione, gli obiettivi ad immersione in olio si possono proficuamente usare solo con preparati permanenti, fissati disidratati e montati in balsamo del canada. Questo se si vuole una buona risoluzione, altrimenti si avrebbe un ingrandimento inutile, che non aggiunge particolari.

A proposito di resina, ai tempi del liceo avevo realizzato qualche semplice vetrino montato con balsamo del canada. Ricordo che la resina che sporgeva dal copioggetto poteva essere rimossa facilmente il giorno dopo con una pezzetta imbevuta di xilolo.
Ora quel balsamo si è seccato e ho pensato di comprare l'Entellan e qui sono iniziate le difficoltà.
L'Entellan è abbastanza denso e tende spesso a imprigionare bolle d'aria nel preparato, cosa rara col balsamo, e soprattutto, contenendo l'entellan stesso xilolo, non riesco a pulire i bordi dei vetrini perché lo xilolo si infiltrra e asporta la resina anche sotto il vetrino.
Qualcuno mi può dare suggerimenti per un uso corretto? Grazie.
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

Mi sembra evidente che continuare a rispondere a queste affermazioni è inutile, ma aggiungo solo che la risoluzione dell'obiettivo è data da:

R = λ/(2NA)

L'indice di rifrazione del mezzo non ha nessun effetto sulla risoluzione, ma solo sul contrasto finale.... E, ribadisco, in ricerca si ottengono le massime risoluzioni possibili (e anche oltre la risoluzione ottica) su campioni immersi in agar o soluzioni acquose.


:think: :shifty:
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Grazie della risposta, poi se vuoi la chiudiamo qua, però dalla dormula citata risulta, a parità di lunghezza d'onda, che il potere risolutivo aumenta con l'apertura numerica e per avere l'AN dichiarata di un obiettivo ad immersione in olio bisogna che ci sia olio fra lente e vetrino.
Poi che altre metodiche permettanolo stesso e di più con altri mezzi è un altro discorso. Dico che, purtroppo, per arrivare ai 1000-1300 ingrandimenti dichiarati, il venditore ti da un obiettivo ad immersione in olio con AN 1,3 che non è comodo da gestire, almeno per me che non sono in laboratorio.
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

In conclusione, gli obiettivi ad immersione in olio si possono proficuamente usare solo con preparati permanenti, fissati disidratati e montati in balsamo del canada.
Io direi proprio di no

E' da vedere cosa si intende per "proficuamente" dal mio punto di vista preparati temporanei in acqua si osservano sfruttando buona parte delle capacità delle ottiche con n.a. maggiore di 1 con l'immersione omogenea.
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

3nzo ha scritto: 14/10/2018, 13:43 ...per avere l'AN dichiarata di un obiettivo ad immersione in olio bisogna che ci sia olio fra lente e vetrino.
No, perche' l'ottica di un obiettivo biologico a immersione omogenea e' studiato per risolvere il problema dell'aria tra esso e il copri vetrino, tra il copri vetrino e il vetrino deve esserci liquido con indice di rifrazione simile all'acqua altrimenti peggiori le cose (aberrazioni cromatiche in primis). Forse il calo di risoluzione che noti tu quando osservi campioni vivi immersi in un liquido acquoso e' dovuto a due fattori, 1 la purezza di tale liquido, 2 forse non sai che l'olio in un obiettivo in immersione omogenea (una volta era indicato cioe' c'era scritto HI, ora e' sottointeso) va messo anche sul condensatore e deve essere ben distribuito tra questo e il vetrino.
:wave:

P.S.: guarda un po' la seconda foto, l'obiettivo fa uso di sola acqua e dichiara una a.n. di 1,23...da risultati migliori di molti in olio da 1,30 di a.n.:
viewtopic.php?f=84&t=5949&hilit=water+i ... =45#p98951
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Intendevo per proficuamente la massima risoluzione.

E' da vedere cosa si intende per "proficuamente" dal mio punto di vista preparati temporanei in acqua si osservano sfruttando buona parte delle capacità delle ottiche con n.a. maggiore di 1 con l'immersione omogenea.
[/quote]

Per i preparati in acqua, per immersione omogenea intendi obiettivi ad immersione in acqua o cosa altro?
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

500paolo ha scritto: 14/10/2018, 14:07
No, perche' l'ottica di un obiettivo biologico a immersione omogenea e' studiato per risolvere il problema dell'aria tra esso e il copri vetrino, tra il copri vetrino e il vetrino deve esserci liquido con indice di rifrazione simile all'acqua altrimenti peggiori le cose (aberrazioni cromatiche in primis). Forse il calo di risoluzione che noti tu quando osservi campioni vivi immersi in un liquido acquoso e' dovuto a due fattori, 1 la purezza di tale liquido, 2 forse non sai che l'olio in un obiettivo in immersione omogenea (una volta era indicato cioe' c'era scritto HI, ora e' sottointeso) va messo anche sul condensatore e deve essere ben distribuito tra questo e il vetrino.
:wave:

P.S.: guarda un po' la seconda foto, l'obiettivo fa uso di sola acqua e dichiara una a.n. di 1,23...da risultati migliori di molti in olio da 1,30 di a.n.:
viewtopic.php?f=84&t=5949&hilit=water+i ... =45#p98951
La foto sopra sembra migliore, la prima...
OK, è una idea che ho avuto anche io, usare obiettivi ad immersione in acqua. Saprai che il Lomo 70/1.23 apo è copia di una ottica Zeiss del 1890. Ottima soluzione, con qualche minimo fastidiucci: la parafocare è qualche decimo più corta degli altri obiettivi e la distanza di lavoro varia con la posizione dell'anello di correzione. Ti è capitato passando da un'altra a questa ottica di dover abbassare il tubo con la macro per mettere a fuoco?
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

Non devi vedere la qualità della foto ma il soggetto, le diatomee nella prima foto mostrano le strie e i dot anche con un semplice 40x 0.65, per quella della seconda foto ci vuole una apertura numerica di almeno 1,30, uso di illuminazione fortemente obliqua e fonte luminosa dal blu agli UV...sul forum ne abbiamo parlato moltissimo e tutti ci siamo misurati con la Amphipleura Pellucida :lol:

C'e' un vetrino denominato "8 form test" montato da un professore inglese specializzato in queste cose, Kemp, che viene usato da molti di noi per testare la risoluzione e la qualita' dei nostri obiettivi, infatti sono 8 diatomee messe in fila e di ognuna puoi vedere i particolari a partire da un certo ingrandimento, se la diatomea relativa non ti mostra i suddetti dettagli, evidentemente il tuo obiettivo o e' danneggiato o e' di scarsa qualita'.

La 8 e' bello scoglio per i 100x, se gia' vedi le strie (righe) hai un discreto obiettivo, in realta' non sono righe ma una fila di forellini detti dot, ma per intravvederli ci vogliono obiettivi al top e da 1,40 di a.n. in su, luce obliqua, luce blu e se vuoi andare sul sicuro, meglio gli UV ma in questo caso assolutamente senza mettere gli occhi sugli oculari ma solo tramite reflex o oculare digitale!
3nzo ha scritto: 14/10/2018, 16:34 Ti è capitato passando da un'altra a questa ottica di dover abbassare il tubo con la macro per mettere a fuoco?
Si chiamano problemi di parfocalità e si risolvono con questi:
https://www.ebay.it/itm/SLIM-8mm-10mm-1 ... :rk:3:pf:0

Io no ho parecchi di tutte e tre le misure, alcuni me li ha forniti Guido, altri li ho comprati dal venditore del link.
Chiaramente si allunga di qualche millimetro il percorso ottico ma e' del tutto trascurabile.
:wave:
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

Per i preparati in acqua, per immersione omogenea intendi obiettivi ad immersione in acqua o cosa altro?
Per immersione omogenea si intende un liquido tra coprioggetto ed ottica e tra vetrino e condensatore, il liquido dipende da cosa è previsto per l'obiettivo, quindi olio, acqua per i water o i pochi altri previsti, a prescindere da cosa si trova tra coprioggetto e vetrino.
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Intendi olio fra condensatore e vetrino e fra vetrino e obiettivo e preparato fra i vetrini in acqua? Hai mai provato questa soluzione, si ottengono immagini nitide?
Temo che l'acqua fra i vetrini non renda omogeneo il percorso della luce e comunque abbassi l'apertura numerica.
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

Hai capito bene, pochi lo usano magari per pigrizia, ma il sistema corretto è questo.
Obiettivo, olio, coprivetrino, preparato, vetrino, olio, condensatore.
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Grazie, ma il dubbio è questo:
condensatore, olio, vetrino, preparato, vetrino, olio, obiettivo
ma il preparato deve essere montato con balsamo del canada o può essere anche in acqua e se in acqua, si perde in AN e risoluzione?
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

Intendi olio fra condensatore e vetrino e fra vetrino e obiettivo e preparato fra i vetrini in acqua? Hai mai provato questa soluzione, si ottengono immagini nitide?
E' il sistema che uso sempre e del resto l'unico possibile quando osservo organismi acquatici.

importante che lo strato di acqua sia il più sottile possibile compatibilmente con quanto si osserva.

Il mezzo, acqua nel nostro caso, non ha alcuna influenza, come del resto già spiegato da Dunadan, sulla risoluzione ma solo sul contrasto, è per questo motivo che i preparati permanenti delle diatomee, ad esempio, vengono fatti con resine ad alto indice di rifrazione.
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

E' una buona notizia perché anche io vorrei dedicarmi ai microrganismi acquatici e pensavo di dover mettere da parte l'obiettivo ad immersione in olio.
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Re: ABC

Messaggio da Dunadan »

Dammi retta che per gli organismi acquatici il 100x lo lascerai sempre da parte per vari motivi. Non ultimo il ridotto campo visivo incompatibile con la velocità con cui si muovono quelle bestiacce......
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

Infatti, concordo con Dunadan, io ti consiglio di non andare oltre il 25x, gia' col 40x se non gli togli il liquido in cui nuotano e quindi ti sbrighi a vederli prima che il copri vetrino li schiacci o l'osmosi li fa scoppiare, ti fai venire l'ipertensione. :mrgreen:

Esistono 25x con la a.n. di normali 40x e oltre e in piu' ci guadagni rispetto a quelli una luminosità impressionante. :wave:
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

Non capisco perchè si debba pensare che non si possa andare oltre i 25x per le osservazioni di organismi acquatici, dipende da cosa si osserva ovviamente, tra l'altro l'uso dell'olio non capisco quali difficoltà presenti se non quella di pulire sommariamente l'ottica con una pezza.

Le immagini che seguono sono fatte tutte in immersione omogenea, la prima con un 50x oil, le altre come da regolo. Non saranno chissà che perfezione ma sicuramente meglio di un crop x 4:
Allegati
EugleneVik50x.JPg
Mastax 100x nik czj10x.jpg
2014_gen_Surirella63xLR.jpg
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

No Guido, parliamo di organismi che si muovono, non statici, chi ha scritto acquatici non intendeva nel vero senso della parola ma che vivono in acqua e sono pieni di vita. ;)
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

Voglio solo dire che è controproducente non abituarsi ad usare tutte le ottiche solo perchè scomode, quando capiterà l'occasione giusta non si sarà in grado di fare uno scatto decente.

Con gli organismi "agitati" è sicuramente pù difficile ma è questione di pazienza e sicuramente sono la fonte delle maggiori soddisfazioni, non credo che l'eudorina si possa considerare statica:
Allegati
Eudorina 100x.jpg
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Re: ABC

Messaggio da 500paolo »

Certo, non diciamo sia impossibile, anche io ne ho fatto molti di scatti con obiettivi in immersione sopra al 70x e l'ho scritto anche sopra, ma e' scomodo e in molti casi non ti da uno sguardo di insieme ma di particolari.
Se invece mi stai parlando della semplice immersione anche con obiettivi medi, intorni al 40-50x non ho nulla da recriminare, ma andare dietro a un protista con un 100x la vedo dura.
Quindi non sto dicendo di non utilizzarli ma solo che hanno una loro funzione come quelli a ingrandimento medio, altrimenti i microscopi verrebbero forniti con un unico ingrandimento.
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Quale era per favore la sequenza del percorso ottico, forse (condensatore)olio-vetro-acqua-vetro- olio(obiettivo)?
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Re: ABC

Messaggio da Mariano Curti »

Ciao a tutti,
in micologia,gli obiettivi a olio io li uso sempre e con preparati " usa e getta " e vanno benissimo.
Quando osservo in micro per studiare una specie, devo misurare le spore i cistidi, basidi ecc. e tutto questo con un 100X in olio. ( uso anche il 50X sempre in olio con optovar).
Devo dire però che quello che osservo e misuro sono immagini statiche e non in movimento.
Ricordo per l'ennesima volta che gli obiettivi ad olio hanno una marcia in più.
Saluti,
Mariano.
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Scusate sto annoiando, ma non ho avuto ancora una risposta chiara per un principiante come me. I preparati usa e getta con le spore sono, diciamo, montate in acqua, cioè c'è acqua fra i vetrini e olio fra coprioggetti e obiettivo?
Fra l'altro i funghi e le spore sono un altro campo di mio interesse. In caso di dubbio si può riconoscere una specie dalla forma e dimensioni delle spore o le dimensioni delle spore non sono costanti?
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Guido Gherlenda
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Re: ABC

Messaggio da Guido Gherlenda »

Ripeto sinteticamente quanto detto più volte nel corso di questa discussione:

Per osservazioni con ottiche ad immersione la sequenza partendo dal basso è:

-Condensatore
-Olio (o il liquido previsto per l'ottica), ci sono oli ad alta viscosità che evitano che l'olio coli, ad esempio il Cargille Type B
-Vetrino;
- Preparato immerso in liquido, nel caso in discussione acqua ma può essere altro, dipende da cosa stiamo osservando;
-Coprioggetto
-Olio (o liquido previsto per l'ottica)
-Ottica, rigorosamente prevista per l'immersione, in caso contrario si rischiano infiltrazioni di olio molto difficili, se non impossibili, da pulire;


Nel caso di preparati montati in modo permanente non cambia nulla, in ogni caqso olio sopra e sotto.
Il montante non influenza la risoluzione ma il contrasto, comunque indispensabile avere lo strato di liquido tra vetrino e coproggetto il più sottile possibile compatibilmente con quanto si osserva, le ottiche ad alti ingrandimenti, specialmente se planapocromatici, hanno un distanza di lavoro cortissima, motivo per il quale spesso non si mettono a fuoco gli oggetti appoggiati al fondo se si è esagerato con lo strato di liquido, è buona norma avvicinare della carta assorbente al bordo del coprioggetto per assorbirne l'eccesso facendo attenzione a non schiacciare i soggetti


Riguardo le spore: ogni specie ha una spora diversa, non solo per dimensione ma anche per forma e superfice, i preparati non destinati ad essere conservati possono essere montati in acqua, nolla vieta però di provare a montarli in altri liquidi, glicerina o lo stesso olio da immersione ad esempio, fare delle prove per proprio conto è alla base delle osservazioni.
Mariano è imbattibile in questo campo...
Guido Gherlenda
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Re: ABC

Messaggio da 3nzo »

Grazie a tutti per i chiarimenti. :thumbup:
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Re: ABC

Messaggio da arturoag75 »

Guido Gherlenda ha scritto: 15/10/2018, 23:07 Voglio solo dire che è controproducente non abituarsi ad usare tutte le ottiche solo perchè scomode, quando capiterà l'occasione giusta non si sarà in grado di fare uno scatto decente.
4 righe per dire tutto quello che c'è da dire..
Ormai mi sono stufato di ripetere quanto un'ottica ad immersione sia piu' luminosa, contrastata, risolutiva rispetto ad una a secco di pari ingrandimento..io oramai le uso anche in visuale anche se non ne possiedo molte, ma fosse per me userei solo quelle.
"Chi non ha pazienza rinunci all'idea di essere un buon microscopista"; questa non è una frase mia ma si trova sulla maggior parte dei testi dedicati! Io sottoscrivo!
Arturo
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