Coloranti e reagenti in micologia

[Mariano Curti]

Ciao a tutti,
i coloranti, come i reagenti sono di importanza fondamentale per la classificazione.
Molte volte queste sostanze chimiche, si utilizzano anche per le osservazioni dei caratteri più fini in microscopia.
Iniziamo con un elenco base di queste sostanze....( ce ne sono altre ma che per il momento non interessano i neofiti....)

COLORANTI:
1) Rosso congo
2) Rosso congo ammoniacale
3) Blu di metilene,
4) Blu toluidina
5) Blu cotone in acido lattico
6) Fuxina.

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REAGENTI:
Reagente di Melzer o reagente Lugol. ( Importantissimo )
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Iniziamo dal Rosso Congo.
E' venduto in polvere oppure già preparato in flaconcini è, come dice la parola di colore rosso vivo.
Le pareti delle ife, dei cistidi, dei basidi e delle spore moltissime volte ( nei basidi e ife sempre) sono ialine, quindi la trasparenza può, soprattutto per un neofita impedire l'sservazione micro di alcuni particolari fini. In questo frangente, il colorante ci aiuta moltissimo e alcune volte serve per l'analisi di alcuni tipi di cuticole gelificate....infatti il gel di queste cuti ( pileipellis) è congofobo...cioè non si colora al rosso congo. Esso separa il gel dagli altri tessuti ed è di grande aiuto per le classifcazioni.

Il Rosso congo ammoniacale è identico nell'uso ma ha il vantaggio di far risparmiare un passaggio nella preparazione del vetrino. Esso si usa per il materiale secco....una goccia sul preparato si rigonfia e si colora contemporaneamente.
Ecco una foto di una palizzata imeniale mentre la seconda è un basidio bisporico...( notare gli sterigmi simili a piccole corna in coppia).

[Mariano Curti]

Adesso passiamo al Blu di toluidina.
Questo colorante ha due proprietà importanti.
La prima colora di viola il gel della pileipellis ( cuticola) se ovviamente presente mentre il resto della cute rimane blu.
La seconda è la metacromasia. Questo fenomeno è importante per separare nel genere Lepiota s.l. il genere Macrolepiota e altri generi vicini.( Utile anche in altri generi come separazione da quelli più vicini.)....
Si dice spora metacromatica quando l'endosporo ( cioè la membrana che sta sotto l'episporio che è la parte più superficiale della cellula) si colora di un bellissimo rosa rosso lasciando però l'episporio trasparente ( cioè ialino).....
La prima fotografa le spore al naturale senza colorante.
La seconda le spore con il colorante ( metacromasia)
La terza è la spora singola vista più da vicino con gli strati colorati e non.

[Mariano Curti]

Come si vede, la prima foto raffigura le spore al naturale dove, a parte la forma, si nota solo il poro germinativo apicale. Il colore è sbiadito ed è quasi trasparente.
Nella seconda foto il colorante è andato a colorare lo strato intermedio di un bel rosa rosso lasciando poi la parte più interna di colore blu.
Nella terza foto notiamo la spora ingrandita....Dove il bordo è rimasto al naturale ( ialino ) mentre la striscia rosa rosso divide il perisporio ( cioè la parte ialina) con l'interno di colore diverso ( bluastro). Si nota all'apice il poro germinativo in maniera anche più netta.
E' una delle più belle colorazioni e in visione diretta è davvero spettacolare...!
Dimenticavo:
la specie trattata in queste colorazioni è la Macrolepiota excoriata. ( fungo comune nei campi e pascoli in autunno ed è anche un ottimo commestibile).
Le foto della metacromasia le ho eseguite con il magnifico NPL Fluotar Leitz 50 X Oil A. 1

Al momento aspetto vs. considerazioni sperando in una partecipazione più convinta.
A presto,

Mariano.

[Francesco R]

Grazie infinite per la condivisione..
aggiungerò al prossimo ordine il rosso congo e il blu di toluidina..
Per utilizzare questi coloranti i preparati devono essere molto sottili immagino.. per ottenere buoni risultati si usa un microtomo oppure si fa una sezione più fine possibile e poi si schiaccia? Quando il fungo è troppo duro per essere schiacciato si ammorbidisce con ammoniaca (ho provato ma con scarso successo)?

Mi scuso per le domande ma sto facendo prove e dopo le foto che avevo proposto ho fallito nell'osservazione di altri funghi (erano piuttosto lignificati e anche una singola lamella era troppo spessa e rigida..).-

[Mariano Curti]

Ciao Francesco,
io comprai un microtomo manuale....poi l'ho usato per pelare le patate.
Basta una buona lente 10X ( magari da tavolo ) meglio se illuminata per fare preparati idonei.( con l'ausilio di una lametta da barba).
Per quanto riguarda i generi, a parte le Polyporaceae in s.l. usa per il secco la soda o la potassa al 5% .....perchè l'ammoniaca rigonfia ma non ammorbidisce...... Se poi aspetti il fresco, non ci sono problemi: basta l'acqua distillata..... Quando è stagione, di funghi freschi ne trovi a tonnellate.....
A PROPOSITO: se fai un ordine il primo prodotto che devi acquistare è il melzer ( oppure il Lugol...è uguale e anche meno tossico..).......
Ti consiglio l'ordine giusto per iniziare,
Soda o Potassa al 3 oppure 5%, ( anche ammoniaca ), regente di Melzer ( oppure Lugol ), Rosso Congo e Blu di toluidina....
I preparati devo essere più sottili possibili......ma se usi il fresco tutto è più facile......( si schiaccia meglio ed è più morbido per natura), con il secco una buona lente da tavolo è quanto di meglio puoi procurarti......( io utilizzo uno stereomicroscopio) le lenti da tavolo si possono acquistare nei mercatini che vendono un po' di tutto e a pochi soldi.
A presto,

Mariano.

[Francesco R]

Grazie come sempre per i suggerimenti..

La soda è il normale idrossido di sodio in scaglie? Basta diluirlo opportunamente?
Riguardo al microtomo vedrò perchè con le lamette e i bisturi ho grosse difficoltà a ottenere buone sezioni sottili.. però immaginavo che il microtomo a mano non fosse molto utile..

Melzer e Lugol servono per identificare la presenza di amido vero?

[Mariano Curti]

Ciao,
la soda ( la soda caustica) è quella commerciale che si vende a scaglie.....puoi fartela anche da solo.....è semplice, basta diluirla con acqua distillata.....se poi invece del 5 ti viene 4 o 6% non succede nulla.....Ti conviene fartela da solo senza spendere soldi.
Il Melzer e il Lugol hanno le stesse applicazioni....il loro componente di base è lo iodio.Ecco perchè puoi scegliere l'uno o l'altro. Verissimo.....servono a verificare la presenza di amidi che sono presenti solo in spore di alcuni generi. (il genere Amanita comprende subgeneri a spore amiloidi e spore inamiloidi... La micidiale Amanita phalloides le ha amiloidi mentre la pregiatissima Amanita caesaria ( Ovulo buono) le ha non amiloidi. Il genere Russula e il genere Lactarius possiedono spore amiloidi dove la reazione è evidente in tutta la spora ma evidentissima nelle decorazioni... Anche le Melanoleuca hanno spore amiloidi ecc. ec...... Con il Melzer o il Lugol si può verificare anche la pseudoamiloidia ( o destrinoidia) dove la spora prende il colore del Melzer o Lugol concentrandolo in maniera molto forte e quindi la colorazione della cellula diventa marrone molto scuro o marrone scuro rossiccio. Quando non è presente questa reazione la spora è di un colore marrone chiaro che ricorda quello del melzer ( o Lugol)......In seguito farò vedere in foto cosa avviene. Quindi acquista uno dei due non tutti e due altrimenti avresti due doppioni...!! Io ti consiglio il Lugol ( ma va benissimo anche il Melzer).
Con il microtomo a mano puoi provare benissimo....io non lo uso forse perchè sono imbranato o molto probabilmente ho sempre seguito altre tecniche.
UNA IMPORTANTISSIMA RACCOMANDAZIONE..!! Quando hai il materiale secco e devi verificare l'amiloidia o altre colorazioni non usare mai la soda o la potassa per rigonfiare il tessuto, esse alterano questi processi...! Usa sempre l'ammoniaca 2 - 3 %......!!! Oppure l'acqua distillata ( ma devi aspettare una mezzoretta).
A lla prossima.

Mariano.

[Mariano Curti]

PROVIAMO ADESSO L'AMILOIDIA.

Per darvi un'idea di questa importantissima reazione microchimica ( ma può essere anche macrochimica nei funghi...Boletus ec.) ho fotografato spore al microscopio di un Lactarius sp.

Come si procede per fare il vetrino. ( In questo caso materiale secco.)

1) prendere un pezzettino di lamella e appoggiarla sul vetrino.
2) mettere una o due gocce di ammoniaca 2 - 3 %. ( NON SODA O POTASSA...! Come ho detto in precedenza possono alterare tali reazioni...!)
3) dopo circa un paio di minuti asciugare e mettere una o due gocce d'acqua distillata.
4) asciugare e mettere sul pezzettino di lamella una o due gocce di Melzer o Lugol...( in questo caso ho utilizzato il Lugol).
5) dopo 3 - 4 minuti asciugare e mettere una o due gocce di acqua distillata.
6) una volta lavato rimettere una o due gocce d'acqua distillata e appoggiare il vetrino coprioggetto.
7)) Schiacciare.

Le prime due foto mostrano:
La prima le spore al taglio ottico ( con il fuoco sul bordo).
La seconda con il fuoco sulla parete sporale che mette in evidenza le verruche sulla parete.
le due foto sono solo in acqua distillata senza il Melzer.

[Mariano Curti]

Adesso le spore della stesso Lactarius sp. trattate al reagente di Lugol.
QUESTA È L'AMILOIDIA...!
Provate ad osservare le prime due foto senza Lugol e poi le ultime due con il reagente.
Saluti e alla prossima.

Mariano

[Guido Gherlenda]

Complimenti, dopo aver tanto letto senza aver tratto delle conclusioni su come partire finalmente ho le idee molto più chiare.

Le tue spiegazioni sono molto ben fatte e di rapido apprendimento anche per un neofita come me, spero di riuscire a metterle in pratica a breve.

Non ultimo: immagini perfette!

[Mariano Curti]

Ciao a tutti,
grazie per i complimenti...ma credetemi , è più facile metterlo in pratica che scriverlo...è semplicissimo.
Provateci....in primavera iniziano i funghi primaverili e potrete fare prove sul fresco. Ad es. è già in atto la "fioritura" di Geopora sumneriana sotto i cedri....provate con questo ascomicete....un cedro su due ospita questo fungo fatto a forma di coppa seminterrata.
Con l'arrivo di maggio e giugno ( soprattutto) i funghi esplodono anche nei boschi .....come posso posterò foto di funghi in habitat che ci possono interessare . ( ad es, generi, Lactarius e Russula).

Mariano.

[Mariano Curti]

Ciao a tutti,
dimenticavo: affrontare una materia del genere è molto complessa e riuscire a farsi capire da chi è giustamente un neofita non è affatto facile.
Se non capite uno o più punti basta chiedere.
Per Guido e altri eccellenti fotografi:
acquisendo queste principali nozioni, potrete benissimo affrontare l' argomento come più vi aggrada....ad es. potrete dedicarvi solo alla foto micro tecnico micologica che pone infiniti risvolti molto più ad es. delle Diatomee che per quanto affascinanti non hanno le variabili tecnico micro che hanno i funghi.
Qundo aveste visto la foto ad es. della spora in primo piano della Lepiota excoriata con il fenomeno della metacromasia, avete visto una cellula di circa 15 micron di lunghezza.....! Non avete visto una diatomea da 100 micron......la bellezza e l'interesse di queste alghe è indiscutibile ma nei funghi la micro, oltre alla variabilità delle dimensioni di molti organi micro, abbiamo la variabilità delle tecniche dove, per osservare alcuni caratteri, ci vogliono procedimenti specifici.....15 micron per una spora nel mondo dei basidiomiceti è considerata medio - grande...! Mentre negli ascomiceti si hanno spore fino a 100 micron ( ma sono eccezioni) anche se la media è di 12 - 50 micron.......
Alla prossima.

Mariano.