Limite di risoluzione del microscopio ottico

[Stefano Barone]

Per pura curiosità di mezzanotte ho effettuato uno scatto in campo chiaro ad un vetrino micrometrico con un obiettivo 100x ad apertura 1,3 senza utilizzare l'olio (quindi l'immagine è da buttare), ma vorrei addormentarmi fantasticando sul limite di risoluzione teorica valido per i microscopi ottici, che per definizione è di circa 0,2 micrometri ...

Fra l'altro al momento il mio migliore condensatore ha un'apertura massima pari a 0,9/1,2 ma conto di aggiungerne anche uno di apertura 1,4.

Osservate l'immagine http://imageshack.us/photo/my-images/41/jou9.jpg/ : i 10 micrometri corrispondono allo spazio fra una tacca e l'altra (che per correttezza dovrebbero essere calcolati non fra gli spazi bianchi, bensì per esempio tra la fine della tacca nera precedente e la fine di quella successiva). Ingrandendo l'immagine sul mio notebook ho notato che 1 micrometro corrisponde a 40 pixel, pertanto 0,2 micrometri corrisponderebbero a 8 pixel, sempre che il mio vetrino micrometrico sia adeguatamente tarato.

Credo che sia possibile distinguere la distanza di due punti anche in uno spazio più piccolo di 8 pixel, ingrandendo l'immagine. Si otterrebbero anche migliori risultati con un'illuminazione obliqua, che accresce il potere risolutivo degli obiettivi, tecnica che molti utilizzano per fotografare le diatomee non disponendo per esempio del contrasto interferenziale.

Secondo questo ragionamento, avendo a disposizione un ottimo microscopio ottico e una reflex digitale a pieno formato altrettanto valida (che quindi supera di gran lunga la nostra capacità visiva), il limite di risoluzione teorico allora può essere rivisto.

Vediamo se siete bravi: è corretta questa ipotesi?

La prossima volta uso l'olio


Ciao,

Stefano

[Gerardo]

Secondo questo ragionamento, avendo a disposizione un ottimo microscopio ottico e una reflex digitale a pieno formato altrettanto valida (che quindi supera di gran lunga la nostra capacità visiva), il limite di risoluzione teorico allora può essere rivisto.
Vediamo se siete bravi: è corretta questa ipotesi?

Naturalmente no. Il limite teorico di risoluzione del microscopio ottico non deriva dall'acuità visiva dell'occhio, né tantomeno dalla risoluzione del sistema di rilevamento fotografico, ma dipende solo dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata e dall'apertura numerica massima possibile compatibilmente con l'indice di rifrazione del mezzo attraverso cui si propaga la luce. In sostanza per arrivare a 0,266 µm ti serve un microscopio con sistema ottico in olio APO con AN = 1.5 e una lunghezza d'onda della luce blu a 400 nm (0,2 è un limite già ottimistico). Certo, se tu potessi usare un sistema di illuminazione e di rilevamento fotografico a luce ultravioletta, diciamo a 200 nm, a parità di sistema ottico potresti avere circa 0,13 µm di risoluzione. Ma, per quanto il sistema di focalizzazione della luce sia a lenti, non utilizzando più la luce che puoi vedere "con gli occhi" avrei qualche dubbio che sia ancora possibile parlare di microscopia "ottica".

[Stefano Barone]

Buonasera a tutti, trovo solo ora il tempo per riprendere dopo tanti mesi l'argomento e per dimostrare che la mia provocazione ha dei concreti fondamenti...

A pagina 128 del volume “Practical Digital Photomicrography” del Dr Brian Matsumoto potete leggere “DIC is extremely sensitive for observing fine structures. It can provide sufficient contrast to detect objects smaller than the resolving power of the microscope. DIC has been used to visualize single microtubules – protein polymers that are 0,025 microns in width, or almost one-tenth the limiting resolution of the microscope. Moreover DIC is amenable to computer-generated contrast enhancement. This provides even more sensitivity in detecting minute objects”. Si tratta fra l'altro uno dei tanti esempi che avvalorano la grande utilità scientifica del DIC, giusto per rispondere a una recente ed interessante discussione aperta da un altro utente del forum.
Tornando all'argomento in oggetto ecco due esempi di pubblicazioni scientifiche che dimostrano come con una buona camera, un buon pc e un ottimo microscopio ottico da ricerca sia possibile raggirare/superare il limite risolutivo:
a) “Visualizing individual microtubules using bright-field microscopy” di Braulio Gutiérrez-Medina (Department of Biology, Stanford University) e Steven M. Block (Department of Applied Physics, Stanford University) in American Journal of Physics, novembre 2009
Di seguito alcune interessanti citazioni: “Microtubules are filament-shaped, polymeric proteins (~25 nm in diameter) involved in cellular structure and organization. We demonstrate the imaging of individual microtubules using a conventional bright-field microscope, without any additional phase or polarization optics. Light scattered by microtubules is discriminated through extensive use of digital image-processing, thus removing background, reducing noise and enhancing contrast. (…) Using a simple setup, we have demonstrated that individual microtubules can be visualized through video-enhanced, bright-field microscopy.” L'articolo è scaricabile comodamente da internet facendo una semplicissima ricerca on-line.
b) Salmon, E. and Tran, P., High-resolution video-enhanced differential interference contrast (VE-DIC) light microscope., Video Microscopy, Sluder, G. and Wolf, D. (eds), Academic Press, New York, pp. 153–184 (1998).
Di seguito una citazione: “In the early 1980s Allen, Ionué and others discovered that the electronic contrast enhancement capabilities of video cameras could make visible the fine structural detail barely resolvable by the DIC microscope and structures such as 25 nm diameter microtubules which are nearly an order of magnitude smaller than the diffraction limit. Both cameras and digital image processors have advanced significantly since the early 1980s and now video-enhanced DIC methods are easily implemented “

Buon approfondimento!

Stefano

[cielo17]

Con le elaborazioni grafiche ed gli algoritmi riescono a superare i limiti teorici.
Anche in astronomia usano degli algoritmi per aumentare i dettagli ed il contrasto, le immagini elaborate mostrano particolari che non sono visibili osservando l'immagine iniziale.